培養(yǎng)基在使用之前必須進(jìn)行滅菌處理，將其所含活菌全部殺死或全部除去。常用的滅菌方法有過(guò)濾除菌、干熱滅菌、濕熱滅菌及輻照滅菌等。其中，濕熱滅菌法又包括四種方式:煮沸法、流動(dòng)蒸汽滅菌法、間歇滅菌法和壓力蒸汽滅菌法。通常來(lái)說(shuō)，使用比較多的是壓力蒸汽滅菌法。
但是對(duì)于有些培養(yǎng)基來(lái)說(shuō),高壓條件會(huì)損壞培養(yǎng)基中的某些成分,不利于培養(yǎng)基的使用，所以只能采用煮沸滅菌的處理方法。本文主要就煮沸滅菌方法進(jìn)行討論。
有關(guān)煮沸滅菌的描述,通常有如下幾種方式:
a、稱取本品41.5g,加熱溶解于1000mL蒸餾水中,煮沸不要超過(guò)2分鐘。無(wú)需高壓滅菌。臨用時(shí)制備，不得超過(guò)3小時(shí)。
b、稱取本品50.3g,加入1000mL蒸餾水中，加熱煮沸至完w全溶解，冷至45-50℃，搖勻，傾入無(wú)菌平皿備用。無(wú)需高壓滅菌。
c、稱取本品89g,煮沸溶解于1000mL蒸餾水中，冷至45-50℃時(shí)，傾入無(wú)菌平皿，備用。注:無(wú)需高壓滅菌。
d、稱取本品57g,加熱攪拌溶解于1000mL蒸餾水中，不要過(guò)分加熱，冷至50-55℃時(shí)，傾入無(wú)菌平皿,部分開(kāi)蓋干燥2h,然后蓋上，備用。無(wú)需高壓滅菌。在24小時(shí)內(nèi)使用。
這些方法描述中，都特別強(qiáng)調(diào)“無(wú)需高壓滅菌"、“不要過(guò)分熱"、“煮沸充分溶解",那么究竟該怎樣操作，才能達(dá)到既滅菌完w全又盡量降低對(duì)培養(yǎng)基的破壞呢?
1、關(guān)于煮沸方式，有人提出可以隔水煮沸，但經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這種煮沸方式存在兩大弊端:
①溫度不夠，達(dá)不到滅菌效果;
②經(jīng)隔水煮沸的含瓊脂培養(yǎng)基,在水浴的過(guò)程中易出現(xiàn)分層現(xiàn)象。
2、為了對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行有效煮沸滅菌,根據(jù)我們實(shí)踐摸索，建議如下操作:
①準(zhǔn)備好電磁爐和搪瓷缸(不要用鐵質(zhì)容器);
②將培養(yǎng)基按比例加水，稱量至搪瓷缸中，用玻璃棒不斷攪拌，直至完w全溶解、無(wú)明顯團(tuán)狀物或顆粒;
③將搪瓷缸置于電磁爐上，大火燒開(kāi)，期間持續(xù)攪拌,避免糊底;當(dāng)液面完w全沸騰后，立即將搪瓷缸從電磁爐上拿開(kāi),算是一次煮沸操作;液面回落后，立即放回電磁爐,重復(fù)上面的步驟;總共煮沸3次即可。
④將煮好的培養(yǎng)基冷卻至需要的溫度,進(jìn)行傾注平皿等操作。
注意事項(xiàng)
1、補(bǔ)水
加熱煮沸的過(guò)程，培養(yǎng)基中的部分水分會(huì)蒸發(fā)掉，造成水分偏少，影響培養(yǎng)基的質(zhì)量(如平板強(qiáng)度等)，導(dǎo)致菌落形態(tài)等結(jié)果的偏差，因此為了盡量減少誤差,需要在煮沸之前，向搪瓷缸中補(bǔ)加適量培養(yǎng)基配制用水，經(jīng)驗(yàn)估計(jì),通常每煮一缸培養(yǎng)基需補(bǔ)加15-20mL水，實(shí)際操作中，需根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室的具體情況(容器大小及裝量)進(jìn)行摸索。
2、溶解
所有的培養(yǎng)基，在煮之前必須攪拌至完w全溶解，不允許將尚有成團(tuán)培養(yǎng)基的狀態(tài)下，直接進(jìn)行加熱煮沸,那樣很容易出現(xiàn)滅菌不徹d底的現(xiàn)象，尤其是有些含瓊脂的培養(yǎng)基,甚至?xí)胁糠汁傊荒軓豥底溶解，導(dǎo)致倒出的平皿上有明顯的麩皮狀瓊脂小顆粒，或者有些含有染料的培養(yǎng)基也可能出現(xiàn)染料顆粒,都會(huì)影響培養(yǎng)基的使用。
3、攪拌
煮沸全程必須持續(xù)不斷攪拌,以免糊底。
4、防燙
液面沸騰后，要及時(shí)將搪瓷缸從電磁爐上取下，以免液體沸出，造成培養(yǎng)基沾染或燙傷操作人員。
