TRIzol RNA提取試劑盒其操作方便、快捷。 在TRIzol中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會(huì)要求用無RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4小時(shí)。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分鐘，用水徹di漂洗干凈后高壓滅菌備用。
（一）試劑準(zhǔn)備
1．TRIzol試劑。
2．氯仿
3．異丙醇
4．75%乙醇（DEPC H2O配制）
5．DEPC H2O
（二）操作步驟
1． 樣品處理：
（1）培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞1-5×107，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
（2）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。
3．4℃離心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。
5．4℃離心，12000g×10min，棄上清。
6．加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。
7. 晾干，加入適量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事項(xiàng)
1．樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會(huì)使內(nèi)源性RNase的抑制不wan全，導(dǎo)致RNA降解。
2．實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格防止RNsae的污染。
二、總RNA定量
RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當(dāng)于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用1cm光徑，用 ddH2O稀釋DNA樣品n倍并以ddH2O為空白對照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：
RNA（mg/ml）=40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)(n)/1000
RNA純品的OD260/OD280的比值為2.0，故根據(jù)OD260/OD280的比值可以估計(jì)RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質(zhì)存在；比值太高，則提示RNA有降解。
 |
 |
 |
