相信屏幕前的你，可能被 shRNA 干擾實驗困擾了無數(shù)個日日夜夜......
亦或是屢屢想嘗試，卻次次與之失之交臂......
......被困擾的你是跪在哪一步了呢？
......而止步于起點的你又是因為什么呢？
今天寫作這篇文章的目的呢，正是為幫助做實驗的你縷清思路。讓在干擾實驗門口「探頭」的你，系統(tǒng)的了解整個流程，從而讓入門不再只是想象。
下面我要開始放大招了：
（一）shRNA 干擾機制＆shRNA 設(shè)計
shRNA（short/ small hairpin RNA）干擾機制圖解
shRNA 組成：
shRNA 包括兩個短的反向互補序列，中間由莖環(huán)（loop）序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，隨后連上 5～6 個 T（轉(zhuǎn)錄終止信號）
手動設(shè)計，原則：
A. 首先靶位點選擇應(yīng)該避開基因的非編碼區(qū)；
B. 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù) 3 個或以上的 T，這可能導(dǎo)致 shRNA 轉(zhuǎn)錄的提前終止；
C. Stratagene 發(fā)現(xiàn) 29 個寡核苷酸抑制目的基因表達的效率比 23 個寡核苷酸的高；
D. 在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個 C，使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生；
E. shRNA 目的序列的個堿基必須是 G 以確保 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以 G 開頭，必須在緊連正義鏈的上游加一個 G；
F. shRNA 插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央，比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán)，5'TTCAAGAGA3' 序列zui為有效；
G. 5～6 個 T 必須放置在 shRNA 插入片段尾部以確保 RNA 聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄；
shRNA 設(shè)計好并合成之后，通過同源重組或者是酶切連接的方法進行干擾載體構(gòu)建，構(gòu)建成功后大量抽提質(zhì)粒（去內(nèi)毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右），以備轉(zhuǎn)染。
