1 、操作因素
1.1 涂片太厚 在涂片時細菌挑的太多，沒法分開，在脫色時就不能將第一步染上的結(jié)晶紫的顏色脫去，可能會使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認為革蘭陽性菌。
1.2 脫色時間
陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時間條件下的結(jié)果，如果延長脫色時間，也會使脫色劑滲透進陽性菌的細胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上復紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時間太短的話又會使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能wan全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認為革蘭陽性菌。
1.3 固定方法
固定不僅能殺死細菌，改變細菌對染料的通透性，還能使細菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實際操作中有的同學將玻片在火焰上烤的太久，改變了細菌原有的通透性，會使細菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
2 、細菌因素
2.1 細菌培養(yǎng)時間
細菌的典型形態(tài)、染色性是在對數(shù)生長期，取這時的細菌做革蘭染色可以反應細菌的真實的染色性。如果細菌培養(yǎng)時間太長，變成了老齡菌，染色性就會發(fā)生變化，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
2.2 培養(yǎng)基的成分
一般認為革蘭陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復合物，它與碘和結(jié)晶紫的復合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細菌與碘和結(jié)晶紫的復合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3 、染液因素
3.1 碘液
碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時間太長，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
3.2 結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。
3.3 酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95% ，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當酒精的濃度為70% 時，它的脫色能力最qiang強，可能使革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
綜上所述，影響染色的其他因素，還有菌體細胞的構(gòu)造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結(jié)構(gòu)完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養(yǎng)基的組成、菌齡、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色，所以我們在染色時要注意當染色結(jié)果與預想的結(jié)果出現(xiàn)不一致時，要考慮到這些因素的影響。對同學來講重點強調(diào)操作因素的影響，使他們在一開始學習革蘭染色，就認真對待，養(yǎng)成良好的學習態(tài)度，嚴格按照操作規(guī)程來做，提高實驗結(jié)果的準確性。
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